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ELISA检测试剂盒应用ding性夹心免疫检测ji术
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出处:www.weikeqi-biotech.com   fen类:公司新闻  fabu:2020-2-20 13:51:47   yue读:(1378)

  ELISA检测试剂盒应用ding性夹心免疫检测ji术,用合成的HEV(Hepatitis E virus戊型肝炎病du)多肽抗原包被微孔banbantiao,这些多肽是中国型HEVdu株he心氨基酸序列中抗原性很强的肽duan,fen别来自yu该du株的开放yue秎iang?和开放yue秎iang?。jiangyang品或jia入孔中并孵yu,如果其中存在HEV IgM抗ti,这些抗ti就会yuHEV 的多肽抗原结合,并固ding在上面,xibanchu去其它非特异性抗ti和yang苀en械钠渌煞荨H缓骿ia入羊抗人IgM-HRP(辣根过氧化物酶)酶结合物,经dier次孵yu后,酶结合物就会yu次孵yu结合上的HEV IgM抗ti相结合,xibanchu去未结合的酶结合物,jia入TMBdi物溶液,在di三次孵yu时会fasheng酶-di物fan应,只有那些含有HEV IgM抗ti和酶结合物所形成的fu合物的孔才会fasheng颜色bian化,jia入硫酸溶液终止酶和di物间的fan应,并在bochang: 450nm处测liangO.D.值,按照本HEV IgM抗tielisa试剂盒的测试标zhun, O.D.值dayu或等yuCut-Off值的yang品被认为是初试阳性。

  ELISA的基础是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶标记。结簒ian诠滔嘣豻i表面的抗原或抗ti仍保持其免疫xue活性,酶标记的抗原或抗ti既保留其免疫xue活性,又保留酶的活性。在测ding时,受检标本(测ding其中的抗ti或抗原)yu固相载ti表面的抗原或抗ti起fan应。用xidi的fang法使固相载ti上形成的抗原抗tifu合物yu液ti中的其ta物质fen开。再jia入酶标记的抗原或抗ti,也通过fan应er结簒ian诠滔嘣豻i上。此时固相上的酶liangyu标本中受检物质的liang呈一ding的比例。jia入酶fan应的di物后,di物被胒u呋晌猩玞han物,chan物的liangyu标本中受检物质的liang直jie相guan,gu可根据呈色的深浅进行ding性或dingliangfen析。由yu酶的催化效率很高,间jie地放da了免疫fan应的结果,使测dingfang法达dao很高的敏感度。

  ELISA可用yu测ding抗原,也可用yu测ding抗ti。在这种测dingfang法中有三个必要的试剂:(1)固相的抗原或抗ti,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗ti,称为“酶联物”、“结合物”(conjugate);(3)酶fan应的di物。根据试剂的来yuan和标本的情况以及检测的具titiao件,可设计出各种不同类型的检测fang法。用yulin碽u煅榈腅LISA主要有以下ji种类型:

  在lin碽u煅橹校朔ㄊ视脃u检验各种蛋bai质等dafen子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获de针对受检抗原的异性抗ti,就可用yu包被固相载ti和制备酶结合物er建立此法。如抗ti的来yuan为抗xueqing,包被和酶标用的抗tifen别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗ti,一般xuan择两个针对抗原上不同决ding簇的单抗,fen别用yu包被固相载ti和制备酶结合物。这种shuang位dian夹心法具有很高的特异性,er且可以jiang受检标本和酶标抗ti一起保温fan应,作一bu法检测。

  shuang抗ti夹心法是检测抗原chang用的fang法di物xian色。固相上的胒u呋痙i物成为有色chan物。通过比色,测知标本中抗原的liang。  在lin碽u煅橹校朔ㄊ视脃u检验各种蛋bai质等dafen子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获de针对受检抗原的异性抗ti,就可用yu包被固相载ti和制备酶结合物er建立此法。如抗ti的来yuan为抗xueqing,包被和酶标用的抗tifen别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗ti,一般xuan择两个针对抗原上不同决ding簇的单抗,fen别用yu包被固相载ti和制备酶结合物。这种shuang位dian夹心法具有很高的特异性,er且可以jiang受检标本和酶标抗ti一起保温fan应,作一bu检测。

  在一bu法测ding中,当标本中受检抗原的含liang很高时,过liang抗原fen别和固相抗ti及酶标抗ti结合,er不再形成"夹心fu合物"。类同yu沉淀fan应中抗原过剩的后带现象,此时fan应后xian色的吸guang值(位yu抗原过剩带上)yu标zhun曲线(位yu抗ti过剩带上)某一抗原浓度的吸guang值相同(参见1.3.2,图1-4),如按chang法测读,所de结果jiang低yu实际的含liang,这种现象被称为钩状效应(hook effect),yin为标zhun曲线dao达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严zhong时,fan应甚謑iang刹粁ian色er出现假阴性结果。yin此在使用一bu法试剂测ding标本中含liang可异chang增高的物质(例如xueqing中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应zhu意可测穌uanУ闹怠S酶遯in和li的单克隆抗ti制眆u死嗍约liang上魅豕匙葱вΑⅫ/p>

  假使在被测fen子的不同位dian上含有多个相同的决ding簇,例如HBsAg的a决ding簇,也可用针秠uan司鰀ing的同一单抗fen别包被固相和制备酶结合物。dan在HBsAg的检测中应zhu意亚型问ti,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决ding簇的fan应性,这也是用单抗作夹心法应zhu意的问ti。

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